Validación y evaluación de una prueba de RT-PCR en tiempo real in house para la detección de SARS-CoV-2 usando un gen específico RdRp y control endógeno GAPDH / Validation and evaluation of RT-PCR real time in house test to detection of SARS-CoV-2 using specific RdRp gene and GAPDH endogen control

RESUMEN Se validó y evaluó un método de RT-PCR en tiempo real usando cebadores y sondas específicas para los genes RdRP de SARS-CoV-2 y GAPDH de humanos; este último fue usado como control endógeno. Se evaluó la especificidad y sensibilidad; además, se evaluó otros parámetros como la robustez, la repetibilidad, reproducibilidad, comparabilidad y el límite de detección. La sensibilidad, especificidad, los valores predictivos positivo y negativo, la robustez, comparabilidad y la repetibilidad-reproducibilidad de la prueba de RT-PCR en tiempo real dúplex fue de 100%, con un límite de detección de 100 copias/µL, de acuerdo con los criterios de aceptación establecidos para validación del protocolo. Esta prueba estandarizada es una buena alternativa para el diagnóstico de COVID-19; además, la prueba fue aplicada de manera exitosa en personas sospechosas de la enfermedad permitiendo controlar el número de falsos negativos.

ABSTRACT The present work validated and evaluated a duplex real-time RT-PCR using specific primers and probes for genes RdRp from SARS-CoV-2 and GAPDH from humans; the latter was used as an endogenous control in all reactions. We evaluated the specificity, the sensitivity, the robustness, the reproducibility, the repeatability, the comparability, and the limit of detection. The predictive positive and negative values (PPV and PNV, respectively) and all the parameters evaluated using our duplex real-time RT-PCR was 100%. The detection limit was 100 copies/µL according to the acceptance criteria established for the validation of this protocol. Our duplex real-time RT-PCR demonstrated to be a good alternative for the diagnosis of COVID-19; in addition, this PCR was used adequately in suspicion of COVID-19, allowing it to control the number of false-negatives.

Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama) / Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama)

RESUMEN Objetivos: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. Materiales y métodos: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. Resultados: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. Conclusiones: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

ABSTRACT Objectives: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. Materials and methods: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. Results: The venom's LD50 was 3.96 μg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 μL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. Conclusions: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

Especies rickettsiales en casos humanos con síndrome febril agudo inespecífico en Perú / Rickettsial species in human cases with non-specific acute febrile syndrome in Peru

RESUMEN Con el objetivo de caracterizar molecularmente aislamientos rickettsiales procedentes de humanos con síndrome febril agudo inespecífico se realizó un estudio descriptivo transversal, con aislamientos propagados en cultivos celulares Vero ATCC y líneas alternativas, verificando viabilidad mediante Inmunofluoresencia Indirecta (IFI). Previa extracción del ADN, se amplificó el gen gltA mediante PCR convencional, y se analizó su secuencia. Doce aislamientos fueron amplificados, cinco con suficiente ADN para secuenciarlos, evidenciando compatibilidad con R. asembonensis en cuatro, y estrecha identidad con Coxiella burnetti en uno. Al menos tres de siete líneas celulares alternativas mostraron rendimiento significativo en sub cultivos. Se identificó R. asembonensis en cuatro aislamientos de humanos con síndrome febril agudo inespecífico, procedentes de las regiones de Ayacucho, Cajamarca y Madre de Dios en Perú, y Coxiella burnetti en uno procedente de la región Loreto.

ABSTRACT With the objective of molecularly characterizing rickettsial isolates from humans with non-specific acute febrile syndrome, a cross-sectional descriptive study was conducted, with isolates propagated in Vero ATCC cellular cultures and alternative lines, verifying the viability by means of Indirect Immunofluorescence. Prior to DNA extraction, the gltA gene was amplified by means of conventional PCR, and its sequence was analyzed. Twelve isolates were amplified, five with sufficient DNA so as to sequence them, exhibiting compatibility with R. asembonensis in four, and a close identity with Coxiella burnetti in one. At least three of seven alternative cellular lines showed significant yield in sub-cultures. R. asembonensis was identified in four isolates of humans with non-specific acute febrile syndrome, coming from the regions of Ayacucho, Cajamarca, and Madre de Dios in Peru, and Coxiella burnetti in one coming from the Loreto region.

Detección de Leishmania (V) guyanensis en ejemplares de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) recolectados en pecaríes de collar (Pecari tajacu) / Detection of Leishmania (V) guyanensis in Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) collected from Pecari tajacu

Resumen Introducción. En estudios previos se detectó la presencia de Leishmania infantum en Rhipicephalus sanguineus, lo cual planteaba la posibilidad de que R. sanguineus transmitiera la leishmaniasis a una variedad de huéspedes. Objetivo. Identificar Leishmania (Viannia) spp. en garrapatas recolectadas en animales silvestres de una zona endémica para leishmaniasis. Materiales y métodos. Se hicieron 81 extracciones individuales de ADN en las garrapatas recogidas de tres tapires o dantas (Tapirus terrestres) y tres pecaríes de collar (Pecari tajacu) cazados en Madre de Dios, Perú. Las garrapatas recolectadas se identificaron taxonómicamente y se prepararon para la identificación del cinetoblasto (kDNA) de Leishmania (Viannia) spp. mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como de la especie de Leishmania mediante PCR de fusión de alta resolución (High Resolution Melt, HRM). Resultados. Se detectó el kDNA de Leishmania (V) spp. en tres garrapatas silvestres de R. (Boophilus) microplus, Canestrini, 1888, recolectadas en un pecarí de collar cazado en la selva de Madre de Dios. El análisis mediante HRM-PCR evidenció que una de las muestras positivas de kDNA tenía una curva compatible con L. (V) guyanensis. Conclusión. Los resultados evidenciaron la presencia de ADN de L. (V) guyanensis en R. (Boophilus) microplus, probablemente adquirida después de picar al pecarí. Es importante hacer nuevos estudios para aclarar la participación de R. (Boophilus) microplus en la transmisión de la leishmaniasis.

Abstract Introduction: Previous studies identified the presence of Leishmania infantum in Rhipicephalus sanguineus and indicated the possibility that it could transmit leishmaniasis to a variety of hosts. Objective: To identify parasites of Leishmania (Viannia) spp. in ticks collected from wild animals in an endemic area for leishmaniasis. Materials and methods: We performed 81 individual DNA extractions from ticks collected from three Tapirus terrestris and three Pecari tajacu in Madre de Dios, Perú. Ticks were taxonomically identified and they were subsequently prepared to identify Leishmania (Viannia) spp. kDNA by PCR and the species of Leishmania by HRM-PCR. Results: Leishmania (Viannia) kDNA was detected in three wild ticks of the species R. microplus, collected from a collard peccary (P. tajacu) hunted in the forests of Madre de Dios. The HRM-PCR showed that one of the positive samples had a kDNA curve compatible with L. (V) guyanensis. Conclusion: The results showed the presence of L. (V) guyanensis DNA in R. microplus possibly acquired after biting a collarde peccary. Therefore, it is important to design future studies to clarify R. microplus involvement in the transmission of leishmaniasis.

Perfil epidemiológico y molecular de Rickettsiosis en localidades de frontera peruana / Epidemiological and molecular profile of Rickettsiosis in peruvian border locations

RESUMEN Objetivos. Determinar circulación de rickettsias durante los años 2010 al 2011 en localidades fronterizas de cuatroregiones del Perú, y sus características clínicas epidemiológicas y moleculares. Materiales y métodos. Estudio transversal realizado en Tumbes, Tacna, Madre de Dios y Loreto. Se obtuvo datos clínicos epidemiológicos y muestras de sangre total para cultivo y para ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Fue utilizado ADN extraído de cultivos de leucocitos y de ectoparásitos, aquellos genes específicos para rickettsias que amplificaron exitosamente fueron secuenciados y analizados. Resultados. El 33,8% de los encuestados portaba anticuerpos a rickettsias; en Loreto 21,7%, en Madre de Dios 33,0%, en Tacna 48,2% y en Tumbes 33,3%, encontrándose seropositividad en más del 40% de aislamientos confirmados por IFI. Las pruebas moleculares evidenciaron la presencia de Rickettsia felis en Ctenocephalides felis de perros y gatos de Tacna y una especie recientemente reportada para Latinoamérica: Candidatus Rickettsia asemboensis en pulgas Ctenocephalides felis de gatos y perros de Loreto y Madre de Dios. De la población estudiada, el 81,4% informó antecedentes de contacto con ectoparásitos, el 22,6% eran asintomáticos y el 27,8% habitaban viviendas sin agua ni desagüe, con piso de tierra. Conclusiones. Evidencias serológicas y moleculares confirman la circulación de rickettsias en las localidades fronterizas estudiadas, con predisponentes epidemiológicos, demostrándose presencia de dos especies: Rickettsia felis y Candidatus Rickettsia asemboensis, las que representarían una amenaza potencial para la salud de los pobladores.

ABSTRACT Objectives. To determine the circulation of Rickettsia in the years 2010 and 2011 in border locations in four regions ofPeru and their clinical epidemiological and molecular characteristics. Materials and Methods. A cross-sectional study was carried out in Tumbes, Tacna, Madre de Dios, and Loreto. Whole blood samples were obtained from participants for culture and indirect immunofluorescence (IIF) testing. The DNA taken from leukocytes and ectoparasite cultures was used, and those genes detected for Rickettsia that were successfully amplified were sequenced and analyzed. Results. A total of 33.8% of those surveyed carried Rickettsia antibodies (21.7% in Loreto, 33.0% in Madre de Dios, 48.2% in Tacna, and 33.3% in Tumbes). Seropositivity was confirmed with IIF in over 40% of isolates. Molecular tests showed the presence of Rickettsia felis in Ctenocephalides felis of dogs and cats in Tacna and a recently reported species for Latin America, Candidatus Rickettsia asemboensis, in fleas of cats and dogs in Loreto, Madre de Dios, and Tacna. Of the population studied, 81.4% reported a history of contact with ectoparasites, 22.6% were asymptomatic, and 27.8% lived in earthen-floored homes without water or drainage. Conclusions. Serological and molecular evidence confirms the circulation of Rickettsia in the border locations studied, with predisposing epidemiological factors. Tests confirm the presence of two species, Rickettsia felis and Candidatus Rickettsia asemboensis, which represent a potential threat to the health of the inhabitants.

Prueba molecular genotype MTBDRplus, una alternativa para la detección rápida de tuberculosis multidrogorresistente / Molecular test genotype MTBDRplus, an alternative to rapid detection of multidrug resistance tuberculosis

La prueba molecular Genotype MTBDRplus, es un método que permite identificar las mutaciones más frecuentes asociadas con la resistencia a las drogas antituberculosas de primera línea: isoniacida (INH) y rifampicina (RIF). El objetivo de este estudio fue evaluar el desempeño de la prueba molecular con cultivos y muestras de esputo con baciloscopía positiva. Se evaluó 95 cultivos y 100 esputos con perfiles de resistencia previamente determinados por el método de referencia “proporciones agar en placa” (APP). La prueba molecular a partir de cultivos mostró una sensibilidad de 100 por ciento;97,5 por ciento y 96,9 por ciento para RIF, INH y multidrogorresistente (MDR) respectivamente; mientras que para esputo la sensibilidadfue de 95,7 por ciento; 96,8 por ciento y 95,2 por ciento para RIF, INH y MDR respectivamente. Se concluye que Genotype MTBDRplus es una herramienta muy útil para la detección rápida de la resistencia a INH y RIF simultáneamente (MDR) en un máximo de72 h a partir de esputo o de cultivo

Variabilidad genética de Aedes Aegypti en algunas áreas del Perú usando single stranded comformational polymorphism (SSCP) / Genetic variability of Aedes aegypti in some Peruvian areas using Single Stranded Conformational Polymosphism (SSCP)

Aedes aegypti es el vector responsable de la transmisión del virus del dengue, su distribución geográfica se haampliado rápidamente debido principalmente a la intervención de los seres humanos. Objetivo: Analizar la variabilidad genética de este mosquito mediante la comparación del Segundo Espaciador Transcrito Interno (ITS 2) perteneciente al ADN ribosomal (rADN). Materiales y Métodos: Se analizaron muestras de ocho localidades (Jaén, Tingo María, Iquitos, Lambayeque, el distrito de El Rimac, Sullana y Zarumilla) y uno de la provincia de Huaquillas (Ecuador). El análisis de la variabilidad se determinó usando la técnica conocida como SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism). Resultados: El estudio muestra que existe variabilidad genética entre las poblaciones analizadas, principalmente entre las muestras localizadas en la costa del Perú (Zarumilla, El Rímac, Sullana) y Huaquillas y las muestras del nororiente (Tingo María, Iquitos, Jaén y Lambayeque) Conclusión: Se determinaron dos variantes genéticas entre las poblaciones de Aedes aegypti: Costeña y Nororiental, que probablemente provienen de dos ancestros diferentes y cuyo ancestro común sufrió de aislamiento por distancia. Se observó que no existe relación entre las distancias genéticas y las distancias geográficas indicando que la migración de estas poblaciones es el resultado de la intervención de los seres humanos que diseminan al vector y no por la migración activa del mosquito. Se plantea el papel de la Cordillera de los Andes en la migración y separación de las poblaciones de Aedes.

Aedes aegypti is the responsible vector for transmission of dengue fever virus, and its geographical distribution has been widely broadened, mainly because of human intervention. Objectives: To analyze the mosquito genetic variability comparing the Second Internal Trascribed Spacer (ITS-2) from the ribosomal DNA (rDNA). Materials and Methods: Samples from seven Peruvian sites (Jaen, Tingo Maria, Iquitos, Lambayeque, Rimac district in Lima, Sullana, and Zarumilla) and one site from Ecuador (Huaquillas Province) were assessed. Variability analysis was determined using the SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) technique. Results: The study shows that there are genetic variability between the analyzed populations, mainly between the samples from the Peruvian northern and central coast (Zarumilla, Sullana, and Rímac) as well as in the Ecuador sample (Huaquillas) and the samples from the northeastern region in Peru (Tingo Maria, Iquitos, Jaen, and Lambayeque). Conclusions: Two genetic variants were determined for Aedes aegypti populations: Coastal and northeastern, which probably come from different lineages, and whose common ancestor became isolated because of the distance. It was observed that there is no relationship between genetic distances and geographical distances, indicating that the migration of the mosquito populations is a consequence of human intervention disseminating the vector and not because of active mosquito migration. We propose that there is a role for the Andes Mountains with respect to Aedes populations migration and separation.

Escherichia coli enteroagregativa en niños con diarrea de un hospital de Lima / Enteroaggregative escherichia coli in children with diarrhea in a Lima hospital

Entre las Escherichia coli diarreogénicas la categoría E. coli enteroagregativa (ECEA) es una de las más importantes y frecuentemente asociada a diarreas infantiles. El presente estudio se realizó con la finalidad de detectar los factores de virulencia que caracterizan a esta categoría patogénica mediante hibridación por colony blot usando sondas de ADN específicas. Se evaluaron 233 cepas aisladas en el laboratorio del Hospital de Emergencias Pediátricas durante los meses de diciembre 1998 y abril de 1999. Del total de muestras analizadas, se encontró que 17,16 por ciento de las cepas poseen el factor de virulencia característico de esta categoría. Los resultados obtenidos demuestran que un importante número de aislamientos de niños con diarrea presentan E. coli enteroagregativa.

Amongst Escherichia coli causing diarrheal disease, enteroaggregative E. coli is one of the most important organisms, and it is frequently associated to diarrhea in infants. The study was performed aiming at detecting virulence factors for the aforementioned organism, using colony blood hybridization with specific deoxyribonucleic acid (DNA) probes. 233 samples isolated in the Pediatric Emergency Hospital Laboratory between december 1998 and april 1999. Of all samples analyzed, it was found that 17,16 per cent of them have the typical virulence factor for their category. The resultsprove that an important proportion of isolates in children with diarrheal disease have enteroaggregative E. coli.

Diseño y evaluación de tres oligonucleótidos para la detección de Leishmania por pcr / Design and evaluation of three olinucleotides for pcr detection of Leishmania

La Leishmania afecta la salud pública en 88 países del mundo y representa un serio obstáculo para su desarrollo socioeconómico. Los métodos para diagnosticar la enfermedad toman tiempo y muchas veces son traumáticos para el paciente. Objetivo: Se aplicó PCR como método alternativo para el diagnóstico rápido de esta enfermedad. Materiales y métodos: A diferentes especies de Leishmania se les extrajo ADN genómico. Se diseñaron tres oligonucleótidos (LEISH 1, LEISH 2 y LEISH 3) dirigidos al extremo carboxilo terminal de la historia H2B de Leishmania (V.) peruaviana cuya secuencia parcial sirvió para diseñar dichos oligos, los cuales fueron probados en un sistema de PCR. Resultados: los oligonucleótidos amplificaron exitosamente regiones de 123 pb (LEISH 2) Y 139 pb (LEISH 1/LEISH 3) de esta secuencia parcial utilizada. La sensibilidad del PCR fue de hasta 1fg de ADN purificado de L (V.) peruviana y de 2 parásitos cuando se realizó la técnica de manera directa. La especificidad fue 100 por ciento (sólo reconoció a Leishmania y no a Trypanosoma ni a humano). Los oligonucleótidos diseñados también amplificaron todas las especies de Leishmania evaluadas. Conclusión: el sistema de PCR diseñado puede ser aplicado en la detección del parásito a partir de cualquier tipo muestra convirtiéndose en un método alternativo de diagnóstico de la enfermedad por su rapidez, especificidad y sensibilidad.